扶芳藤提取物預(yù)防給藥對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注后c-fos表達(dá)的影響

肖 健

(廣西中醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,南寧市 530001 )

=摘要> 目的 探討扶芳藤提取物預(yù)防給藥對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注后大腦c-fos表達(dá)的影響。方法 Longa法制作急性腦缺血再灌注損傷模型,用免疫組化法檢測(cè)腦組織缺血再灌注2、6、12、24 h的c-fos表達(dá)水平。

結(jié)果 扶芳藤提取物能降低再灌注2、6、12、24 h后大鼠腦組織中c-fos的表達(dá)(P<0. 05)。

結(jié)論 扶芳藤提取物對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制可能與下調(diào)缺血腦組織中c-fos表達(dá)有關(guān)。

=關(guān)鍵詞> 扶芳藤提取物;腦缺血再灌注損傷; c-fos

=中圖分類號(hào)> R 743. 31;R 289. 5 =文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼> A =文章編號(hào)> 0253-4304(2007)10-1501-02

Effect of Euonymus fortunei extract on the expression ofc-fos in ratswith cerebral is chem ia-reperfusion injury XIAO Jian(Department ofImmun obiology and Microbiology,Guangxi Tradictional Chinese Medical University,530001China)

=Abstract> Objective To study the effect of extract of Euonymus fortunei (EE) on the expression of c-fos in cerebral ischemia-reperfusion injury rats.M ethods The cerebral ischemia-reperfusion model was prepared by means of Longas' method.The expression of c-fos

were determined by immunohistochemistry.Results The expression of c-foswere decreased in allEE-treated groups after ischemia followed by 2,6,12,24 hours reperfusion.Conclusion The protection ofEE to neuronal injury induced by cerebral ischemia-reperfusion may work by down regulating the expression of c-fos. =Key words> Eutract;Euonymus fortune;i Cerebral ischemia-reperfusion injury; c-fos

扶芳藤[Euonymus fortunei (Turcz. ) Hand#Mazz]是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物,主要分布在我國(guó)山西、陜西、廣西、云南、貴州、湖南、湖北等地,具有補(bǔ)腎強(qiáng)筋,止血化淤、舒筋活絡(luò)的功能。

多年來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)扶芳藤的研究從未間斷,并證明扶芳藤能抑制血栓形成、增進(jìn)超氧化物岐化酶(SOD)活力、延長(zhǎng)心肌缺氧的存活時(shí)間[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)線栓法制造大鼠急性腦缺血再灌注

模型,利用扶芳藤提取物預(yù)防給藥并觀察其對(duì)再灌注損傷過(guò)程中的c-fos表達(dá)水平的影響,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用扶芳藤治療腦缺血疾病探索理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 藥物與試劑

扶芳藤的提取:取扶芳藤1 kg,加入相當(dāng)干藥材10倍量的水,在不銹鋼鍋內(nèi)煮開(kāi)后1 h,過(guò)濾,保留濾液;藥渣再加以8倍于生藥量的水,煮開(kāi)后文火煎30min,過(guò)濾去渣,合并2次濾液,濃縮至相當(dāng)于原生藥量的容量即1 000 ml時(shí),取出冷卻;然后加入95%食用乙醇,邊加邊攪拌,直至藥液中含乙醇為80%時(shí),放置48 h,在前24 h內(nèi)攪拌3~4次,后靜置24 h,過(guò)濾去渣,濾液在旋轉(zhuǎn)回收器中回收乙醇至無(wú)醇時(shí),將無(wú)醇的液體加熱,濃縮成2. 0 g生藥/ml的藥

物,保留于4e冰箱,使用時(shí)再用雙蒸水稀釋成所需濃度。c-fos免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1. 2 給藥方式及途徑

藥物組給予扶芳藤提取物灌胃,灌胃量根據(jù)成人每日臨床用量按人與動(dòng)物之間藥物劑量換算:利用mg/kg折算mg/m2轉(zhuǎn)換因子進(jìn)行計(jì)算[2],每100 g大鼠每日藥量為2 mg, 1次/d,共2個(gè)月。

1. 3 動(dòng)物與分組

W istar大鼠60只,雌雄各半, 3~5月齡,體重250~300 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào): SCXK桂2003-0003。隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、腦缺血再

灌注模型組(以下簡(jiǎn)稱模型組)、腦缺血再灌注給藥組(以下簡(jiǎn)稱給藥組),以上各組均按缺血再灌注2、6、12、24 h四個(gè)時(shí)點(diǎn)

分成4個(gè)亞組,每個(gè)亞組5只大鼠,分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食,喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,飲自來(lái)水。

1. 4 動(dòng)物模型的制作

采用改良Zea Longa,s法[3]制作大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebralartery occulusion,MACO)模型。大鼠用10%水合氯醛(0. 35 ml/100 g)腹腔注射麻醉,仰臥固定,頸部正中線切口,沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣鈍性分離肌肉和筋膜,直到分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈,用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈,結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端及頸總動(dòng)脈,然后在距頸總動(dòng)脈近分叉3~4 mm處剪口,將直徑為0. 24 mm的釣魚線自切口輕輕插入,插入深度約為(18. 5?0. 5)mm,縫合皮膚,皮外留線長(zhǎng)約10 mm。缺血2 h后,將釣魚線向外輕輕拔出10 mm,即可實(shí)現(xiàn)再灌注。

大腦中動(dòng)脈閉塞(MACO)模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn):大鼠蘇醒后表現(xiàn)為: (1)提尾離地時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲; (2)在地板爬行時(shí)向右側(cè)劃圈; (3)站立時(shí)向右側(cè)傾倒。假手術(shù)組按上術(shù)方法施行,但僅分離至頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈后即施行縫合術(shù),不插入釣魚線。

1. 5 腦片制備

大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0. 35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后,仰臥固定,常規(guī)胸腹聯(lián)合切口,將灌流針頭經(jīng)左心室插入主動(dòng)脈,快速灌入200 ml含有0. 01%肝素的生理鹽水,接著滴注400 ml4%多聚甲醛固定液。灌流瓶?jī)?nèi)的液面應(yīng)距離動(dòng)物心臟約高出1 m以使灌流壓略高于動(dòng)物收縮壓。灌流后將動(dòng)物放入裝有4%多聚甲醛固定液的塑料袋中,置4e冰箱內(nèi)1 h,取出斷頭取腦,大腦置4%多聚甲醛固定液中固定2 h。大腦分別置于20%、30%蔗糖的PBS中(4e)過(guò)夜。次日以冰凍切片機(jī)切片,每個(gè)鼠腦約切10片,切片厚度為20Lm,切片貼附于聚賴氨酸載玻片。保鮮膜密閉片盒,置于-20e保存。

1. 6 指標(biāo)檢測(cè)

c-fos表達(dá)的檢測(cè)采用免疫組化染色法,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察,每張切片隨機(jī)觀察8個(gè)視野,胞漿或胞核有棕色顆粒者為c-fos陽(yáng)性細(xì)胞。

1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 14. 0 forW indows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。各組間比較采用方差分析,所有數(shù)據(jù)均以x?s表示,P<0. 05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 形態(tài)學(xué)變化 缺血再灌注模型組缺血灶內(nèi)大量細(xì)胞胞漿染成深棕色的c-fos陽(yáng)性細(xì)胞,隨再灌注時(shí)間增長(zhǎng),細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞周圍間隙增寬,有大量缺血壞死神經(jīng)元,胞體腫脹,胞漿淡染,胞核溶解,結(jié)構(gòu)不清;給藥組模型切片中的細(xì)胞形態(tài)相對(duì)完整、細(xì)胞間質(zhì)比較均勻、致密,可見(jiàn)少量c-fos陽(yáng)性細(xì)胞。

2.2 扶芳藤提取物對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注后c-fos表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較,缺血再灌注模型組、給藥組的c-fos在2、6、12、24 h時(shí)點(diǎn)的表達(dá)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01);但給藥組在各時(shí)點(diǎn)的表達(dá)顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),見(jiàn)表1。

表1 扶芳藤提取物對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注后c-fos表達(dá)的影響(x?s,% )

Table 1 Effecton expression of c-fos in cerebral ischemia-reperfusion injury ratswith ExtractofEuonymus fortumei

組別2 h 6 h 12 h 24 h

假手術(shù)組1. 42?0. 69 1. 00?0. 58 0. 71?0. 49 0. 86?0. 69

模型組34. 00?2. 83 37. 00?5. 16 30. 43?3. 60 28. 86?4. 26

給藥組13. 86?2. 97 14. 58?2. 76 9. 86?2. 34 9. 14?2. 97

3 討 論

1982年,真核細(xì)胞基因組中的原癌基因c-fos被發(fā)現(xiàn),這是一種即基因( immediate-early gene, IEG),其產(chǎn)物FOS蛋白參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié),與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、死亡及損傷修復(fù)有關(guān),其主要機(jī)制為FOS經(jīng)廣泛修飾后與另一種IEG c-jun所表達(dá)的核蛋白JUN形成轉(zhuǎn)錄激活蛋白1 ( activator protein 1,AP-1),AP-1能與DNA調(diào)節(jié)序列相結(jié)合,可被基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列識(shí)別并結(jié)合,從而參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等一系列病理生理過(guò)程。因此c-fos作為核內(nèi)第三信使,在神經(jīng)信號(hào)的傳遞中發(fā)揮重要作用。c-fos對(duì)缺血再灌注等外界刺激可迅速作出反應(yīng)進(jìn)行表達(dá),是反映神經(jīng)細(xì)胞功能狀態(tài)的重要的因素,其基因產(chǎn)物c-fosmRNA和FOS作為細(xì)胞對(duì)缺血反應(yīng)的敏感指標(biāo),可用來(lái)評(píng)價(jià)腦缺血后神經(jīng)損傷程度,因此c-fos的表達(dá)可作為研究腦缺血后細(xì)胞代謝改變的一項(xiàng)新指標(biāo)和測(cè)定藥物對(duì)腦缺血干涉作用的新方法[4]。

正常情況下c-fos在腦內(nèi)表達(dá)水平極低,腦缺血可誘導(dǎo)其大量表達(dá), c-fos表達(dá)與腦缺血后神經(jīng)元的死亡或凋亡呈平行關(guān)系,其表達(dá)程度反映了腦缺血后神經(jīng)元死亡的程度, c-fos表達(dá)越高,相應(yīng)的腦組織損傷越嚴(yán)重[5]。相關(guān)機(jī)制可能是因?yàn)閏-fos的高度表達(dá)后形成的AP-1通過(guò)調(diào)控其下游基因,從而使一些維持細(xì)胞生存的蛋白合成減少,殺手蛋白合成增多引起[6]。

本實(shí)驗(yàn)證明扶芳藤提取物能明顯減少c-fos的表達(dá),提示扶芳藤提取物可能是通過(guò)抑制c-fos的表達(dá),從而降低腦缺血區(qū)半暗帶的細(xì)胞死亡率來(lái)實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)功能。 因?yàn)橛绊慶-fos表達(dá)的因素較多,如興奮性氨基酸(EAA)受體激活和細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多,以及自由基的增多等等,那么,扶芳藤對(duì)腦缺血的保護(hù)作用是否是通過(guò)抑制上述因素的增多來(lái)發(fā)揮效應(yīng)抑或是直接抑制于c-fos來(lái)發(fā)揮效應(yīng),還需進(jìn)一步的研究與摸索。