扶芳藤提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響研究

肖艷芬，黃 燕，王 琳，王 坤，肖 健

(廣西中醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣西 南寧 530001)

【摘 要】

目的 探討扶芳藤提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響。

方法 通過檢測免疫抑制小鼠的臟器/體質(zhì)量比值、巨噬細(xì)胞吞噬率、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率以及血清溶血素的變化，觀察不同劑量水平的扶芳藤乙醇提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響。

結(jié)果 中、高劑量的扶芳藤提取物可明顯提高免疫抑制小鼠的臟器/體質(zhì)量比值、巨噬細(xì)胞吞噬率、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率以及血清溶血素含量(P<0.05)。

結(jié)論 扶芳藤提取物可以增強(qiáng)小鼠免疫功能。

【關(guān)鍵詞】 衛(wèi)矛科; 植物提取物; 扶芳藤; 免疫系統(tǒng)/藥物作用; 小鼠

文章編號(hào)： 1009-5519(2012)12-1768-02 中圖法分類號(hào)： R967 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

扶芳藤[Euonymus fortunei(Turcz.)Hand.-Mazz.]屬衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物，又名換骨筋、小藤仲，《本草拾遺》稱扶芳藤能“主一切血，一切氣，一切冷，去百病。久服延年，變白，不老……”[1]。

前期研究表明復(fù)方扶芳藤合劑具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫功能的作用[2-3]，但是扶芳藤作為復(fù)方扶芳藤合劑方中的君藥，目前對(duì)其藥理學(xué)與免疫學(xué)作用機(jī)制知之甚少。本研究通過建立環(huán)磷酰胺(cyclophos-phamide，Cy)所致免疫抑制小鼠模型 ，利用扶芳藤提取物 (extractof euonymus fortunei)進(jìn)行干預(yù)，探討扶芳藤對(duì)小鼠免疫功能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用扶芳藤提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物的制備

取扶芳藤 1 kg，加入相當(dāng)于藥材 10 倍量的水，在不銹鋼鍋內(nèi)煮開后1 h，過濾，保留濾液 ;藥渣再加 8 倍于生藥量的水，煮開后文火煎30 min，過濾去渣 ，合并兩次濾液 ，濃縮至相當(dāng)于原生藥量的容量即1 000 mL 時(shí) ，取出冷卻 ;然后加入 95%食用乙醇，邊加邊攪拌，直至藥液中含乙醇為80%時(shí)，放置 48 h，在24 h 內(nèi)攪拌 3～4 次后，靜置 24 h，過濾去渣 ，濾液在旋轉(zhuǎn)回收器中回收乙醇至無醇時(shí)，將無醇的液體加熱，濃縮成每毫升2.0 g生藥的藥物，保留于4 ℃冰箱，使用時(shí)再用雙蒸水稀釋成所需濃度[4]。此外，本實(shí)驗(yàn)所用Cy 購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司 ，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H32026196;ConA 為美國 Sigma 公司產(chǎn)品 ，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)配制至100 μg/mL，置-20 ℃冰 箱保存?zhèn)溆?紅細(xì)胞裂解液購自上海博蘊(yùn)生物科技有限公司;2%、10%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、10%雞紅細(xì)胞以及新鮮豚鼠血清由本教研室自備。

1.2 方法

取健康昆明種小鼠 50 只，雌雄各半，6 周齡，體質(zhì)量18～22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK 桂2008-0003。將所有小鼠隨機(jī)分為 5 組：(1)實(shí)驗(yàn)組(扶芳藤提取物加Cy);(2)對(duì)照組(Cy);(3)空白組(生理鹽水)。其中實(shí)驗(yàn)組包括高、中、低3 個(gè)劑量組(高劑量組 200 mg/kg、中劑量組 100 mg/kg，低劑量組50 mg/kg)。各組小鼠分籠飼養(yǎng) ，自由進(jìn)食 ，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒 飼料，飲純凈水。本研究采用Cy制造免疫抑制小鼠模型 ：Cy按 40mg/kg 給實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠腹腔注射 ，每天 1 次 ，共 3 d。實(shí)驗(yàn)組同時(shí)給予扶芳藤提取物灌胃，按相應(yīng)劑量給藥，每天1 次 ，共15 d;對(duì)照組給予生理鹽水腹腔注射。另外再取昆明種小鼠 50 只，按上述方法分組并用藥，用于血清溶血素測定試驗(yàn)。

1.2.1 臟器/體質(zhì)量比值測定

脫頸椎處死小鼠，稱量體質(zhì)量，再分離胸腺、脾臟，稱質(zhì)量后分別計(jì)算臟器指數(shù)。以臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(10 g)作為脾臟和胸腺指數(shù)。

1.2.2 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前 1 d，腹腔注射淀粉溶液2 mL 作為誘導(dǎo)劑 ;實(shí)驗(yàn)結(jié)束前 1 h，腹腔注射 10%雞紅細(xì)胞0.2 mL，處死小鼠后用 PBS 液 2 mL 洗出腹腔巨噬細(xì)胞 ，將洗出液置于載玻片上，30 min后洗滌，固定，行姬姆薩染色，油鏡下每張片計(jì)100 個(gè)巨噬細(xì)胞 ，并計(jì)吞噬雞紅細(xì)胞的細(xì)胞數(shù) ，吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100 個(gè)巨噬細(xì)胞×100%。

1.2.3 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

取小鼠脾臟置于 2 mL RPMI1640 培養(yǎng)液中研磨，過200 目細(xì)胞篩，1 000 r/min 離心 10 min 后，棄上清液，用紅細(xì)胞裂解液2 mL 重懸后反應(yīng) 7 min，1 000 r/min離心10 min，用RPMI1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，配置成 5×106mL-1細(xì)胞懸液。取96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按每 100 μL 培養(yǎng)基 5×105個(gè)細(xì)胞的量鋪板;加入ConA，使終濃度為 5 μg/mL;將培養(yǎng)板置 CO2培養(yǎng)箱反應(yīng)24 h后取細(xì)胞涂片，行瑞氏染色，油鏡下每張片計(jì) 100 個(gè)淋巴細(xì)胞，并計(jì)中度轉(zhuǎn)化及以上的細(xì)胞數(shù)，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=發(fā)生中度轉(zhuǎn)化及以上的細(xì)胞

/100 個(gè)淋巴細(xì)胞×100%。

1.2.4 血清溶血素的測定

末次給藥前 7 d 給每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2% 綿羊紅細(xì)胞(SRBC)進(jìn)行免疫，末次給藥前 2 d 再次：給予0.2 mL 2% SRBC 進(jìn)行再次免疫，2 d 后斷頸取血，分離血清并稀釋500倍 。另取試管 ，依次加入經(jīng)稀釋的血清 0.5 mL、10%SRBC 0.5 mL、新鮮豚鼠血清 0.5 mL，并加入 45 ℃瓊脂液使瓊脂糖終濃度為1.4%，倒入小平皿并封閉，置 37 ℃水浴孵育 1 h 后計(jì)算空斑形成數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間差異使用 SPSS14.0 軟件進(jìn)行分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 扶芳藤提取物對(duì)小鼠臟器/體質(zhì)量比值的影響

結(jié)果表明 ，空白組小鼠的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，提示小鼠免疫抑制模型的建立是成功的。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，低劑量組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)升高，但是兩組間差異不明顯;中、高劑量組可提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)(中劑量組 P<0.05，高劑量組 P<0.01)和胸腺指數(shù)(P<0.01)。與空白組比較，低劑量組小鼠的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)降低(P<0.01)，中、高劑量組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低但組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表 1。注：與對(duì)照組比較，aP<0.05;bP<0.01;與空白組比較，cP<0.01。

2.2 扶芳藤提取物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

與對(duì)照組比較，中、高劑量組和空白組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率顯著升高(P<0.01)，但低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05);與空白組比較 ，低、中、高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率顯著降低(低劑量組P<0.01，中、高劑量組P<0.05);中 、高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見表 2。

2.3 扶芳藤提取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組和空白組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著升高(低劑量組 P<0.05，中 、高劑量組和空白組 P<0.01);與空白組比較，低劑量組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯降低(P<0.01)，中、高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);中、高劑量組間淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表 3。

2.4 扶芳藤提取物對(duì)小鼠血清溶血素生成的影響

與對(duì)照組比較，中、高劑量組與空白組小鼠溶血空斑形成數(shù)顯著升高(P<0.01);低劑量組溶血空斑形成數(shù)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。與空白組比較，低劑量組溶血空斑形成數(shù)明顯降低(P<0.05);中、高劑量組溶血空斑形成數(shù)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。注：與對(duì)照組比較，aP<0.01;與空白組比較，bP<0.05。

3 討 論

隨著復(fù)方扶芳藤合劑的廣泛應(yīng)用，作為該方劑的君藥，扶芳藤的作用機(jī)制也隨之受到研究者們的重視。扶芳已被證明含有較大比例的衛(wèi)茅醇和扶芳藤多酚[5-6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，扶芳藤可以減少缺血再灌注兔心肌細(xì)胞Bax 蛋白的表達(dá)，升高 Bcl-2，從而抑制再灌注心肌細(xì)胞凋亡[7]。

本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)，扶芳藤提取物可以減少大鼠缺血再灌注腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 的產(chǎn)生，這可能是因?yàn)榉龇继偬崛∥飬⑴c了缺血再灌注損傷過程的免疫調(diào)節(jié)功能[2，8]。提示扶芳藤可能通過相應(yīng)免疫應(yīng)答機(jī)制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。免疫系統(tǒng)是保護(hù)機(jī)體免受外來感染及維持免疫穩(wěn)定與監(jiān)視功能的執(zhí)行者，由免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子3 部分構(gòu)成。免疫器官的體積與質(zhì)量在經(jīng)受免疫抑制藥物(如Cy)作用后會(huì)因大量免疫細(xì)胞的死亡而減少。

本研究發(fā)現(xiàn)扶芳藤提取物可以維持脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)處于正常小鼠水平，表明扶芳藤提取物對(duì)維持免疫器官的質(zhì)量發(fā)揮著重要的作用。機(jī)體針對(duì)外來抗原的第一道防線是天然免，其中巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞同屬天然免疫的免疫細(xì)胞，它主要通過吞噬、消化外來病原發(fā)揮抗感染功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，扶芳藤提取物可以提高免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的功能，提示扶芳藤提取物可能通過促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬能力而行使免疫保護(hù)功能。脾臟是成熟的淋巴細(xì)胞定居與執(zhí)行免疫保護(hù)功能的場所，T淋巴細(xì)胞在脾臟通過識(shí)別抗原，分化增殖為效應(yīng)性T 細(xì)胞繼而發(fā)揮細(xì)胞免疫功能。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)可以檢測 T 淋巴細(xì)胞分化增殖的程度。

本研究發(fā)現(xiàn)扶芳藤提取物能提高免疫抑制小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，表明扶芳藤提取物參與了執(zhí)行細(xì)胞免疫功能。除細(xì)胞免疫外，體液免疫是機(jī)體特異性免疫的另一組成部分，抗體是執(zhí)行體液免疫的主要分子?？贵w在針對(duì)外來紅細(xì)胞的殺傷過程中又被命名為溶血素，它是衡量體液免疫功能最重要的指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)扶芳藤提取物能促進(jìn)溶血素的生成 ，提示它可能具有提高體液免疫應(yīng)答的功能。

表4 各組小鼠淋巴細(xì)胞溶血空斑比較(x±s)

3 各組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率比較(x±s)

2 各組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率比較(x±s)

1 各組小鼠免疫器官指數(shù)比較(x±s)

扶芳藤提取物具有增強(qiáng)小鼠天然免疫、細(xì)胞免疫以及體液免疫功能的作用，這為臨床應(yīng)用扶芳藤提供了理論依據(jù)。但是，由于扶芳藤提取物屬乙醇提取物，其成分比較復(fù)雜，因此，鑒別分析扶芳藤提取物的主要有效成分問題，將需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去研究解決。